Lehrgebiet für Bioverfahrenstechnik (BioVT)

Nutzung neuartiger, regioselektiver Halogenasen für Biotransformationen

Die Bereitstellung halogenierter Verbindungen für chemische Prozesse sowohl als End- als auch als Zwischenprodukte spielt eine bedeutende Rolle. Im Rahmen der Synthese der halogenierten Verbindungen besteht ein zunehmendes Interesse, diese mit Hilfe halogenierender Enzyme durchzuführen. Von großer Bedeutung für solche Verfahren sind dabei die Halogenasen, da sie in Biotransformationen eine selektive und spezifische Halogenierung eines Substrats ermöglichen und somit eine günstige Perspektive für Prozesse der Weißen Biotechnologie bieten. Denkbar ist in diesem Sinne beispielsweise die Substitution klassischer toxischer Halogenierungsagentien wie Thionylhalogeniden oder Sulfurylhalogeniden in der chemischen Darstellung halogenierter Intermediate durch diese Enzyme. Des Weiteren besteht ein besonderes Interesse an solchen Prozessen von Seiten der pharmazeutischen Industrie, da halogenierte Naturstoffe oftmals eine höhere Aktivität als die nicht halogenierten besitzen und von der chemischen Synthesechemie in der Bereitstellung reaktiver Zwischenprodukte. Hintergrund des Projektes war es, ein „proof-of-concept” für die enzymatische Synthese des in Position 5 und 6 halogenierten Tryptophans darzustellen. Die rekombinant exprimierten Tryptophan-5- und Tryptophan-6-Halogenasen wurden zunächst in hoher Reinheit mittels Metallionen-Affinitätschromatographie gewonnen. Aufgrund der FADH2-Abhängigkeit der Halogenasen musste zusätzlich für die Durchführung der Halogenierungsreaktion eine Flavinreduktase (FLR) bereitgestellt werden, welche unter NADH-Verbrauch FAD zum FADH2 reduzierte. Die FLR konnte erfolgreich aus einem rekombinanten E. coli-Organismus isoliert und in einer für die Halogenierungsreaktion ausreichenden Qualität zur Verfügung gestellt werden. Für eine wirtschaftliche Gestaltung des halogenierenden Schritts ist es unerlässlich die notwendigen Enzyme in immobilisierter Form für den Prozess einzusetzen, damit diese recycliert werden können und um deren Standzeit zu erhöhen. Hierzu wurden zunächst die Standzeiten sowie die Kinetik der nativen Enzyme untersucht bzw. optimiert und auf immobilisierte Systeme (Trp-5-Halogenase) übertragen, wobei eine deutliche Verbesserung der Standzeit resultierte. Des Weiteren konnte erfolgreich ein Co-Substrat-Recycling etabliert werden, welches für eine nachhaltige Gestaltung des Halogenierungsprozesses zwingende Voraussetzung ist. Bezüglich des Aufbaus eines kontinuierlichen Halogenierungsprozesses, mit welchem eine höhere Raum-Zeit-Ausbeute als im Batch-Prozess generiert werden sollte, konnten im Rahmen des Projekts erste Voruntersuchungen durchgeführt werden.

Kooperationspartner

Prof. Dr. K.-H. van Pée (TU Dresden)

StatusAbgeschlossenes Projekt
FördermittelgeberBMWi/AiF
Förderzeitraum07/2005 - 06/2008
Fördernummer VIII D2-404240/7

Veröffentlichungen und Tagungsbeiträge

  • K. Muffler, M. Retzlaff, K.-H. van Pée, R. Ulber, Optimisation of halogenase enzyme activity by application of a genetic algorithm, J. Biotechnol. 127 (2007), 425-433
  • A. R. Kuetchou Ngnigha, K. Muffler, A. Ernyei, K.-H. van Pée, R. Ulber, Biologische Halogenierung, Chem.-Ing. Tech. 80 (2008), 783-794
  • K. Muffler, A. R. Kuetchou Ngnigha, R. Ulber, Bestimmung kinetischer Parameter der FADH2-abhängigen Tryptophan-5-Halogenase aus Streptomyces rugosporus, Chem.-Ing. Tech. 82 (2010), 121-127
  • K. Muffler, M. Retzlaff, K.-H. van Pée, R. Ulber, Optimisation of halogenase enzyme activity, European Congress on Biotechnology (2005) Kopenhagen (DK)
  • A. R. Kuetchou, K. Muffler, K.-H. van Pée, R. Ulber, Regioselektive Bio-Halogenierung pharmazeutisch bedeutender Precursor, GVC-DECHEMA Jahrestagungen (2006) Wiesbaden
  • A. R. Kuetchou Ngnigha, K. Muffler, A. Ernyei, K.-H. van Pée, R. Ulber, Continuous production of 5-Cl-tryptophan with tryptophan-5-halogenase using a membrane reactor, BioPerspectives (2008) Hannover
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